Методы оценки микробиоты кишечника человека

Methods for assessing the human gut microbiota

Авторы:

Кара Вадим Васильевич

Научная рота № 8 Главного военно-медицинского управления Вооруженных Сил Российской Федерации, Санкт-Петербург, Россия 

e-mail: vadim29-00@yandex.ru

Kara Vadim Vasilevich

Scientific Company № 8 of the Main Military Medical Directorate of the Armed Forces of the Russian Federation, St.-Petersburg, Russia

e-mail: vadim29-00@yandex.ru

Грачев Андрей Николаевич

Научная рота № 8 Главного военно-медицинского управления Вооруженных Сил Российской Федерации, Санкт-Петербург, Россия 

e-mail: drafchik@mail.ru

Grachev Andrey Nikolaevich

Scientific Company № 8 of the Main Military Medical Directorate of the Armed Forces of the Russian Federation, St.-Petersburg, Russia

e-mail: drafchik@mail.ru

 

Аннотация: В данной статье на основании литературных источников представлены современные данные об основных лабораторных методах оценки микробиоты кишечника человека. Отдельное внимание уделено молекулярно-генетическим методам, позволяющим исследователям изучать микробные сообщества и их потенциальную роль в контексте ряда заболеваний.

Abstract: This article presents current data on the main laboratory methods for assessing the human gut microbiota based on the literature. Particular attention is paid to molecular genetic methods that allow researchers to study microbial communities and their potential role in the context of a number of diseases.

Ключевые слова: микробиота, кишечник.

Keywords: microbiota, 16S, intestine.

Тематическая рубрика: Медицина и психология.

 

Введение.

Микробиота имеет комменсальные отношения с хозяином и играет ключевую роль в поддержании здоровья человека. Гомеостатический баланс кишечного микробиома чрезвычайно важен, так как любые сдвиги в сторону изменения микробного состава могут свидетельствовать о наличии заболевания, а также способствовать его прогрессированию [8, 33]. Поскольку существует множество ассоциаций между микробиотой кишечника и здоровьем человека, особенно важно проанализировать взаимосвязь между изменениями микробиоты кишечника и возникновением, прогрессированием и прогнозом течения заболеваний [36]. Для достижения данной цели были разработаны различные методы оценки микробиоты кишечника, позволяющие изучить не только структуру микробного сообщества кишечника и понять его потенциал посредством общесистемных геномных и транскриптомных исследований, но и изучить функциональные возможности этих микробиомов. 

Культуральные методы оценки микробиоты кишечника 

Традиционно для изучения фекальной микробиоты используются методы бактериологического культивирования на основе элективных сред, таких как агар МакКонки, ксилозо-лизин-дезоксихолатный агар, среда Монсура, желточно-солевой агар и др. Исследования на основе культивирования показали, что фекальная микробиота включает широкий спектр бактерий, которые принадлежат к следующим родам: Bacteroides, Eubacterium, Clostridium, Ruminococcus, Fusobacterium и Bifidobacterium. Однако большинство бактерий фекальной микробиоты являются строгими анаэробами и поэтому их трудно культивировать. Анализы, основанные на микроскопическом исследовании, показали, что от 60 до 70% фекальных бактерий невозможно культивировать. Очевидно, что традиционные методы на основе культивирования дают неполную и предвзятую картину биоразнообразия кишечной микробиоты, поскольку большинство видов бактерий желудочно-кишечного тракта не могут быть культивированы. Таким образом, исследования на основе культур позволили лишь частично идентифицировать таксономический состав фекальной микробиоты [3].

Молекулярно-генетические методы оценки состава микробиоты кишечника.

Для преодоления ограничений, возникших вследствие культивирования бактерий было разработано несколько молекулярно-генетических подходов, в которых различные таксоны бактерий были идентифицированы на основе нуклеотидных последовательностей в образцах кала. Наиболее часто используемый ген-мишень для идентификации бактерий - это 16S рРНК, которая является «золотым стандартом» микробного типирования. Эти методы основаны на расхождении последовательностей 16S рРНК и способны продемонстрировать микробное разнообразие микробиоты кишечника; дать качественную или количественную оценку микробного состава, а также оценить изменения микробного состава при различных заболеваниях. 

Рибосомы бактерий состоят из двух субъединиц: 50S и 30S. В 30S субъединицах и присутствует 16S рибосомальная РНК. Бактериальный ген 16S рРНК имеет длину около 1500 нуклеотидов, с некоторыми вариациями у разных видов. Некоторые участки этого гена высококонсервативны для всех групп бактерий. Эти консервативные или константные последовательности чередуются с областями, которые демонстрируют заметные вариации (гипервариабельные участки); девять таких участков были признаны и обозначены как V1 – V9.

Вариации нуклеотидных последовательностей в этих гипервариабельных областях отражают эволюционное расхождение бактерий, благодаря чему эти последовательности обеспечивают надежный метод идентификации и филогенетической классификации видов бактерий. Способы идентификации бактерий на основе нуклеотидных последовательностей в этих областях имеют то преимущество, что они не требуют предварительной бактериальной культуры и, следовательно, могут обнаруживать бактерии, которые культивируются, а также те, которые плохо растут.

Последовательность гена 16S рРНК была определена для большого числа штаммов. GenBank, крупнейший банк данных нуклеотидных последовательностей, имеет более 20 миллионов депонированных последовательностей, из которых более 90 000 относятся к гену 16S рРНК. Это означает, что существует множество ранее депонированных последовательностей, с которыми можно сравнивать последовательность неизвестного штамма [6].

ПЦР в реальном времени (количественная ПЦР).

Наиболее важной вехой в использовании ПЦР было введение концепции мониторинга амплификации ДНК в реальном времени посредством мониторинга флуоресценции. В ПЦР в реальном времени флуоресценция измеряется после каждого цикла, а интенсивность флуоресцентного сигнала отражает количество специфических продуктов амплификации ДНК - ампликонов в образце в это конкретное время. Среди флуоресцентных реагентов наиболее часто используются интеркалирующие агенты ДНК (такие как SYBR Green) и зонды гидролиза (также известные как зонды TaqMan™). Краситель SYBR Green - это неспецифическая система обнаружения, которая способствует интеркаляции с последующим поверхностным связыванием с двойными цепями недавно амплифицированной ДНК. 

Принцип системы обнаружения с использованием датчиков гидролиза основан на резонансной передаче энергии Фёрстера, когда безызлучательная энергия передается от флуоресцентного донора (флуорофора) к акцептору с более низкой энергией (тушитель) посредством диполь-дипольных взаимодействий на большие расстояния [5]. Это происходит потому, что зонды гидролиза представляют собой небольшие олигонуклеотидные последовательности с двойной меткой: с одной стороны, они помечены определенным флуорофором, а с другой стороны - гасителем. Поскольку флуорофор и гаситель находятся в непосредственной близости, гаситель адсорбирует сигнал репортерного флуорофора. Когда амплификация ДНК происходит во время реакции кПЦР, зонд гидролизуется ДНК-полимеразой Taq из-за его 5'-нуклеазной активности, а флуорофор и гаситель разделяются, испуская флуоресценцию, которая соответствует специфической амплификации целевой ДНК. Большим преимуществом кПЦР с использованием гидролизных зондов является то, что, когда зонды помечены флуорофорами, излучающими флуоресценцию на разных длинах волн, существует возможность проведения мультиплексной реакции кПЦР, в которой более двух мишеней выявляются и количественно определяются одновременно.  

В начальных циклах флуоресценция слишком слабая, чтобы ее можно было отличить от фона. Однако точка, в которой интенсивность флуоресценции превышает определяемый пороговый уровень, соответствует начальному количеству молекул ДНК-матрицы в образце. Эта точка называется циклом количественной оценки (Cq) и позволяет определять абсолютное количество целевой ДНК в образце в соответствии с калибровочной кривой, построенной для серийно разведенных стандартных образцов с известными концентрациями или числом копий. В эту кривую может быть включено наименьшее количество ДНК, обнаруживаемое данным методом (<10 копий целевого гена), чтобы подтвердить его чувствительность. Высокая чувствительность, специфичность и скорость получения результатов позволили широко использовать кПЦР для количественной оценки конкретных патогенов, при которых количество микробов низкое.

Не смотря на то, что кПЦ способен предоставить необходимую информацию за короткое время; однако фенотипические и биохимические особенности должны быть подтверждены на бактериальных изолятах

Таким образом, путем нацеливания на определенные группы бактерий с помощью кПЦР и сравнения их с общим количеством бактерий, присутствующих в образце, можно определить их численность и быстро наблюдать изменения. Не смотря на то, что кПЦ способен предоставить необходимую информацию за короткое время, существуют ограничения в отношении чувствительности анализов, основанных на кПЦР. Образцы для выделения ДНК обычно изначально содержат очень небольшое количество бактерий-мишеней. Это ограничение приводит к наиболее важному недостатку кПЦР, который заключается в присущей ей неспособности различать живые и мертвые клетки.

Полиморфизм длин терминальных рестрикционных фрагментов.

Т-ПДРФ – полиморфизм длин терминальных рестрикционных фрагментов, нацеленный на ген 16S рРНК, является очень эффективным инструментом для анализа бактериальных сообществ, включая некультивируемые виды. Данный метод использует один или два флуоресцентно меченых олигонуклеотидных праймера для амплификации гипервариабельной области гена 16S рРНК бактерий с помощью ПЦР. Ампликоны гена 16S рРНК различных видов, накопленные в большом количестве, подвергаются ферментативному расщеплению эндонуклеазами рестрикции. Затем, образовавшиеся терминальные рестрикционные фрагменты (T-RF) разделяют гель-электрофорезом. Фрагменты разной длины мигрируют на разное расстояние, что приводит к образованию полос. Поскольку каждый фрагмент помечен флуоресцентной меткой, возможно цифровое обнаружение меченного на конце рестрикционного фрагмента. Профиль сообщества можно оценить по количеству и размеру полос в тестируемой выборке. Каждая полоса потенциально представляет отдельный вид.

Несмотря на то, что метод является полуколичественным, быстрым и дешевым, он не может точно охарактеризовать состав микробного сообщества. Это связано с рядом недостатков - тот факт, что считываются только концевые фрагменты, означает, что любые две отдельные последовательности, которые имеют общий концевой сайт рестрикции, будут давать только один пик на электрофореграмме и не будут различаться.  

Флуоресцентная гибридизации in situ.

Флуоресцентная гибридизации in situ (FISH) использует флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуют комплементарные последовательности целевой 16S рРНК. Образец денатурируется и «фиксируется» в растворе для гибридизации - фиксация является решающим шагом для обеспечения оптимальных результатов. Этот этап выполняется с использованием сшивающих агентов (например, альдегидов) или осаждающих агентов (например, метанола или этанола) или их смеси [24].  Добавляют флуоресцентно меченые олигонуклеотидные зонды и инкубируют в течение ночи в растворе для гибридизации при высоких температурах (обычно 65–75 °C). Когда происходит гибридизация, флуоресценцию можно подсчитать с помощью проточной цитометрии, что приведет к идентификации целевых видов.  Преимущества этого метода в том, что он полуколичественный и быстрый. Однако невозможно идентифицировать неизвестные виды с помощью этого метода, но зонды могут быть разработаны для нацеливания на определенные типы или виды.

Метагеномное секвенирование 16S рРНК.

Микробиота желудочно-кишечного тракта представляет собой очень разнообразное сообщество, но большинство бактерий считается некультивируемыми, поскольку более поздние исследования, основанные на секвенировании, выявили большее разнообразие, чем ранее обнаруженное при культивировании [10]. Следовательно, большинство исследований микробиома кишечника человека основывались на методах секвенирования, не зависящих от культуры. Эти исследования позволили получить представление о составе сообщества кишечной микробиоты у здоровых людей, о том, как он изменяется при воздействии окружающей среды [7, 9], и о его потенциальной роли в различных заболеваниях. 

В настоящее время для изучения микробиома человека применяется так называемое метагеномное секвенирование маркерных генов, при котором секвенируется не весь геном, а лишь те его регионы, по которым можно установить родовую и иногда видовую принадлежность микроорганизмов. Чаще всего для амплификации выбирают участки гена 16S рибосомальной РНК (16S рРНК), последовательность которого, с одной стороны, высококонсервативна, а с другой — содержит вариабельные участки, которые отличаются однонуклеотидными заменами в случае с разными микроорганизмами [2]. 

Рабочий процесс 16SNGS начинается с выделения геномной ДНК бактерий из собранных образцов. Геномная ДНК извлекается с использованием стандартных протоколов или коммерческих наборов, а затем количественно оценивается для определения количества и качества извлеченной ДНК. После этого готовятся библиотеки генов 16S рРНК, из которых будут амплифицированы вариабельные области гена 16S рРНК. В зависимости от платформы секвенирования, вариабельная область, выбранная для амплификации, и последовательность для идентификации бактерий могут отличаться, хотя сообщалось, что области V4-V6 являются наиболее репрезентативными для гена 16S рРНК полной длины. Затем проводится предварительная обработка ДНК для получения фрагментов ДНК определенного размера. Затем к амплифицированной области 16S рРНК будут добавлены адаптеры. После этого будет проведена количественная оценка и нормализация ампликонов перед секвенированием.

После завершения секвенирования важна предварительная обработка исходных данных перед биоинформатическим анализом. Это включает в себя проверку и удаление адаптеров секвенирования, оценку общего качества чтения последовательности (проверка качества), обрезку или фильтрацию считываний низкого качества и фильтрацию считываний на основе длины последовательности.  Этот шаг важен для удаления некачественного и ошибочного чтения. Чтобы обнаружить предполагаемые химерные последовательности в отфильтрованных данных, последовательности обычно подвергаются химерной проверке. Последующее сопоставление согласованных последовательностей с эталонной базой данных позволит идентифицировать исследуемые бактерии, а также дополнительно провести функциональную аннотацию белок-кодирующих генов [4].

Заключение.

Совершенствование методов оценки микробиоты кишечника, позволяет исследователям по-новому взглянуть на вопрос её роли в развитии ряда заболеваний. Достижения в области геномных и транскриптомных исследований, применяемые в современных лабораториях, в скором времени станут рутинными методами изучения микробиоты, что позволит повысить качество диагностики различных заболеваний. 

 

Список литературы:

1. Борщев Ю.Ю., Ермоленко Е.И. Метаболический синдром м микроэкология кишечника. Трансляционная медицина. 2014,(1):19-28.

2. Красненко А.Ю., Елисеев А.Ю., Борисевич Д.И., Цуканов К.Ю., Давыдова А.И., Ильинский В.В. Особенности подготовки библиотек для метагеномного секвенирования образцов на платформе Illumina. Вестник РГМУ. 2017, (2): 30–6. DOI: 10.24075/brsmu.2017-02-04 

3. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev. 1995 Mar, 59(1):143-69. doi: 10.1128/mr.59.1.143-169.1995. PMID: 7535888; PMCID: PMC239358.

4. Bartram A.K., Lynch M.D., Stearns J.C., Moreno-Hagelsieb G., Neufeld J.D. Generation of multimillion-sequence 16S rRNA gene libraries from complex microbial communities by assembling paired-end illumina reads [published correction appears in Appl Environ Microbiol. 2011 Aug, 77(15):5569]. Appl Environ Microbiol. 2011, 77(11):3846-3852. doi:10.1128/AEM.02772-10.

5. Chou KF, Dennis AM. Förster Resonance Energy Transfer between Quantum Dot Donors and Quantum Dot Acceptors. Sensors (Basel). 2015, 15(6):13288-13325. Published 2015 Jun 5. doi:10.3390/s150613288.

6. Clarridge JE 3rd. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 2004 Oct, 17(4):840-62, table of contents. doi: 10.1128/CMR.17.4.840-862.2004. PMID: 15489351, PMCID: PMC523561.

7. David L.A., Maurice C.F., Carmody R.N., Gootenberg D.B., Button J.E., Wolfe B.E., Ling A.V., Devlin A.S., Varma Y., Fischbach M.A., Biddinger S.B., Dutton R.J., Turnbaugh P.J. Diet rapidly and reproducibly alters the human gut microbiome. Nature. 2014 Jan 23;505(7484):559-63. doi: 10.1038/nature12820. Epub 2013 Dec 11. PMID: 24336217, PMCID: PMC3957428.  

8. DeGruttola A.K., Low D., Mizoguchi A., Mizoguchi E. Current Understanding of Dysbiosis in Disease in Human and Animal Models. Inflamm Bowel Dis. 2016, 22(5):1137-1150. doi:10.1097/MIB.0000000000000750.

9. Dethlefsen L., Relman D.A. Incomplete recovery and individualized responses of the human distal gut microbiota to repeated antibiotic perturbation. Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Mar 15, 108 Suppl 1(Suppl 1):4554-61. doi: 10.1073/pnas.1000087107. Epub 2010 Sep 16. PMID: 20847294, PMCID: PMC3063582. 

10. Eckburg P.B., Bik E.M., Bernstein C.N., Purdom E., Dethlefsen L., Sargent M., Gill S.R., Nelson K.E., Relman D.A. Diversity of the human intestinal microbial flora. Science. 2005 Jun 10;308(5728):1635-8. doi: 10.1126/science.1110591. Epub 2005 Apr 14. PMID: 15831718, PMCID: PMC1395357.