Биотехнология получения и характеристика культуры изолированных клеток и тканей Rhodiola rosea L.

Biotechnology of obtaining and characterization of culture of isolated cells and tissues rhodiola rosea L.

Автор: Нечаев Дмитрий Юрьевич

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия

e-mail: mitya.nechaev@list.ru

Nechaev Dmitry Yurievich

Military medical academy, Saint-Petersburg, Russian Federation

e-mail: mitya.nechaev@list.ru

Аннотация: Rhodiola rosea L. является исчезающим лекарственным видом с ограниченным распространением, которое имеет исключительное значение для фармацевтической промышленности, для профилактики и лечения рака, заболеваний сердца и нервной системы и много другого. Несмотря на большой интерес к золотому корню и широкие исследования в области фитохимии, биотехнология данного вида оставалась менее изученной и эксплуатируемой. В статье представлены достижения в культивировании in vitro родиолы розовой, а также в индукции органогенных и каллусных культур.

Abstract: Rhodiola rosea L. it is an endangered medicinal species with a limited distribution, which is of exceptional importance for the pharmaceutical industry, for the prevention and treatment of cancer, heart and nervous system diseases, and much more. Despite the great interest in the golden root and extensive research in the field of phytochemistry, the biotechnology of this species remained less studied and exploited. The article presents achievements in vitro cultivation of Rhodiola rosea, as well as in the induction of organogenic and callus cultures.

Ключевые слова: Родиола розовая, микроклональное размножение, биотехнология, лекарственное растение, каллусная ткань, агробактерии, бородатые корни.

Keywords: Rhodiola rosea, microclonal reproduction, biotechnology, medicinal plant, callus tissue, agrobacteria, hairy roots.

Тематическая рубрика: Биотехнологии и экология.

 

Введение.

Родиола розовая (синонимы: золотой корень, розовый корень, альпийский корень) семейства толстянковые (Crassulaceae J.St.–Hil.), является универсальным лекарственным растением с хорошо выраженными адаптогенными свойствами, способным повышать неспецифическую резистентность организма и нормализовать его функции в ответ на различные стрессоры эмоционального, психического и физического происхождения. Золотой корень имеет широкий спектр ценных фармакологически активных компонентов: фенилпропаноидные гликозиды (розавин, розарин, розин), фенольные соединения (салидрозид, тирозол) флавоноиды  (родионин, родиолин, родиозин, ацетилродальгин) фенольные кислоты, танины и фенольные масла, накапливающиеся в корневище растения. Благодаря своему уникальному составу этот вид родиолы, имеет высокую популярность, как в медицине, так и в пищевой промышленности. Родиола розовая характеризуется крайне высокой внутривидовой морфологической и биохимической изменчивостью, поэтому необходимо оптимизировать метод in vitro для конкретных популяций (экотипов) этого вида.

На сырьё из подземной части родиолы розовой имеется высокий коммерческий спрос, который почти полностью удовлетворяется растениями, собранными в дикой среде. В настоящее время родиола занесена в Красную книгу Российской Федерации как редкий вид, а также данный вид включён в Красный список МСОП как вид вызывающий наименьшее беспокойство.

В связи с растущим спросом родиолы розовой на рынке, дальнейшие исследования должны быть направлены на поиск оптимальных путей эксплуатации этого вида. Применение микроклонального размножения и биотехнологических методов является перспективным способом помощи в восстановлении диких популяций золотого корня, а также для получения высококачественных растений с точки зрения выхода биологически активных соединений.

1. Химический состав и биологическая активность Rhodiola rosea.

На сегодняшний день в родиоле розовой идентифицировано более 140 химических веществ. Благодаря многолетним исследованиям фитохимического состава золотого корня, удалось установить структуру большинства биологически активных соединений и определить основные фармакологические эффекты для некоторых из них (Таблица 1).

Таблица 1 – Биологически активные вещества из корневищ и корней родиолы розовой и их фармакологическая активность.

Химические группы	Вещества	Фармакологическая активность
Фенилпропаноидные гликозиды	Розарин, розавин, розин	антиоксидантная, антимикробная, гепатопротекторная, умеренная и кратковременная гипогликемическая, стабильная и выраженная антигипергликемическая, противоопухолевая, противовоспалительная активности.
Цианогенные гликозиды	Лотаустралин, Родиоцианозид А и Б
Флаваноиды	Родионин, родионидин, родиозин, родиолинин, трицин, кемпферол, родалин, родиолгин, родиолин, астрагалин, ацетилродалгин
Тритерпены	Даукостерол, β-ситостерол
Олигомерные / полимерные проантоцианидины	Продельфинидин
Фенолоспирты	Тирозол, салидрозид	адаптагенная, антиоксидантная, антистрессовая, нейропротекторная, иммуномодулирующая, ноотропная активности.
Фенольные кислоты	Кофейная, хлорогеновая, галловая

2. Культура изолированных клеток и тканей Rhodiola rosea.

2.1. Клональное микроразмножение Rhodiola rosea.

На данный момент имеется широкий ряд работ посвященных микроразмножению родиолы розовой, однако результаты этих исследований противоречат друг другу из-за высокого полиморфизма этого вида и наличия многочисленных экотипов.

Первые эксперименты с культивированием клеток и тканей родиолы розовой in vitro и микроразмножению были начаты в конце восьмидесятых годов прошлого века. Дальнейшие исследования были направлены на изучение взаимодействий важнейших факторов (экспланта и его стерилизации, питательной среды, фитогормонов, условий культивирования, генотипа растения) влияющих на создания каллусных, суспензионных и органогенных культур, а также на микроклональное размножение золотого корня. Разнообразие природных форм родиолы розовой затрудняет разработку единого, эффективного, биотехнологического протокола размножения in vitro этого ценного и редкого лекарственного растения. Для эффективного использования технологий in vitro с целью коммерческого культивирования розового корня требуется оптимизация методик для конкретных популяций.

Выбор экспланта для интродукции in vitro имеет решающее значение для успешной реализации морфогенетического потенциала растительных клеток.

Немаловажным фактором в микроразмножении клеток и тканей золотого корня, является стерилизация эксплантов (семян). Деконтаминация изолированных клеток и тканей является важнейшим и затрудненным этапом в культивировании in vitro, это связано с необходимостью создания асептических условий и сохранения жизнеспособности семян и эксплантов.

Питательные среды и фиторегуляторы, также являются важными факторами, влияющими на процессы in vitro культивирования золотого корня. Химический состав среды и ее физические свойства должны соответствовать требованиям каждого этапа развития культуры. Среда Мурасиге–Скуга стала самой популярной в биотехнологических работах с родиолой розовой. Среда обычно дополняется различными комбинациями и концентрациями регуляторов роста. Наиболее часто используемыми фитогармонами в in vitro культивировании родиолы розовой, являются 6–бензиламинопурин (БАП), индолил–3–уксусной кислоты (ИУК), α – нафтил–1–уксусная кислота (НУК), индолил–3–масляная кислота (ИМК) и 2,4–дихлорфеноксиуксусная кислота (2.4–Д). Также было изучено влияние зеатина, 2–N6–(2 изопентил) аденина (2iP), кинетина и тидиазурона (ТДЗ). Различные соотношения ауксинов и цитокининов могут приводить к индукции развития каллуса, корней, почек или побегов, тогда как гиббереллины в основном отвечают за рост органов, но не за их образование. фективность регуляторов роста растения находится в зависимости от его генотипа, что было доказано в многочисленных экспериментах с различными экотипами родиолы розовой. Помимо фиторегуляторов в питательные среды добавляются дополнительные источники азота, например, гидролизат казеина или глутаминовая кислота.

Наилучшие результаты для выявления морфогенетического потенциала могут быть достигнуты при соответствующем балансе между эксплантом, питательной средой, обогащенной фиторегуляторами и другими добавками, а также генотипом исследуемого растения. Таковы важные аспекты в исследованиях каждой научной группы, направленных на создание in vitro культур родиолы розовой.

2.2. Каллусные и суспензионные культуры  Rhodiola rosea

После получения in vitro  культур растений, проводятся работы по изучению их синтетического потенциала для получения ценных вторичных метаболитов методами метаболической инженерии или биотрансформацией. Последний является одним из ключевых механизмов повышения производства биологически активных метаболитов в изолированных клетках и тканях (каллусных и суспензионных культурах). Однако на данный момент существует не так много работ исследующих как потенциал культур родиолы розовой в качестве биотрансформированных in vitro фабрик нацеленных на производство биологически активных веществ, так и оптимизацию методов синтеза БАВ. В данном разделе приводятся метод получения каллусной культуры, который эффективней в биосинтетической и накопительной способности по сравнению с суспензионной культурой клеток родиолы розовой.

C 2004 года руппа ученых (Z. György et al. 2006) исследовали влияние различных прекурсоров биологически активных веществ на биомассу и продукцию метаболитов в компактных каллусных агрегатах (ККА) родиолы в жидкой среде.

В каллусе определяли общее содержание флавоноидов и фенолов. Изучали влияние состава питательных сред на антиоксидантные свойства. Данное исследование может быть положено в основу кальнейшего изучения метаболической инженерии in vitro и биотрансформации для альтернативного производства  БАВ.

2.3. Культура бородатых корней Rhodiola rosea.

Перспективной стратегией повышения биологически активных соединений в родиоле розовой является трансформация с почвенной бактерией Rhizobium rhizogenes Young et al. (ранее Agrobacterium rhizogenes Conn). Поскольку, растения, полученные в результате трансформаций с использованием немодифицированных или диких штаммов бактерий и без использования рекомбинантных нуклеиновых кислот, не классифицируются как ГМО.

Для родиолы розовой было проведено комплексное исследование (K. Tasheva, G. Kosturcova, 2012) по изучению факторов влияющих на трансформацию, а также по разработке методов введение таргетной ДНК R. rhizogenes, а также возможности генетической трансформации золотого корня с целью стимулирования производсва вторичных метаболитов in vitro.  В качестве индуктора волосатых корней использовали штамм Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834.

В качестве объектов трансформации использовали различные типы растительного материала (стеблевые сегменты с листовыми узлами, сегменты побега, листовые сегменты, каллус и целые проростки). Генетическая трансформация выполнялась тремя способами: проливание капель бактериальной суспензии на экспланты, травмирование эксплантов и погружение их в бактериальную суспензию и инъекция саженцев. 

Необходимы дальнейшие исследования как с точки зрения оптимизации состава питательных сред in vitro, так и с точки зрения выяснения взаимодействия между растением и бактериями для обеспечения пролиферации культур бородатых корней родиолы розовой. 

Заключение.

В ходе работы была изучена информация о биотехнологических методах получения и характеристике изолированных культур клеток и тканей родиолы розовой (Rhodiola rosea L.). Таким образом, были изучены биоэкология, состав биологически активных веществ и присущие им фармакологические свойства родиолы розовой, а также методы клонального микроразмножения, биотехнологические методы получения культур клеток и тканей и метод генетической трансформации для повышения синтеза биологически активных соединений. Также были сформулированы следующие выводы:

· Были изучены ботанические и экологические особенности родиолы розовой – универсального лекарственного растения, являющегося редким редким видом во многих странах Европы и Азии. Химический состав золотого корня включает в себя более 140 соединений входящих в десятки химических групп.        

· Литературный анализ продемонстрировал многообразие модификаций протоколов микроклонального размножения родиолы розовой.

· Анализ литературы показал, наиболее перспективный объект для биотрансформации культур родиолы розовой – компактные каллусные агрегаты.

· Литературый анализ показал широкие перспективы работы с методом генетической трансформации, а также оптимизации уже существующих протоколов или создания собственного эффективного способа получения бородатых культур родиолы розовой для повышения синтеза биологически активных веществ с возможностью их идентификации и выделения.

 

Список литературы:

1. Красная книга Российской Федерации (растения и грибы) / Министерство природных ресурсов и экологии РФ; Федеральная служба по надзору в сфере природопользования; РАН; Российское ботаническое общество; МГУ им. М. В. Ломоносова; Гл. ред..: Ю. П. Трутнев и др.; Сост. Р. В. Камелин, Н.А. Некратова и др.– М.: Тов-во научн. изданий КМК, – 2008. – С. 855. – 1000 экз. – ISBN 958–5–87317–476–8.

2. Запесочная Г. Г., Куркин В. А., Щавлинский А. Н. Химическое изучение корневищ и надземной части Rhodiola rosea L. // Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. «Рез–ты и перспективы науч. иссл. в обл. создания лек. средств из раст. сырья». – М., – 1985. – С 92–93.

3. Размножение в культуре in vitro редкого вида Rhodiola rosea с Алтая / А. А. Эрст, А. С. Эрст, А. И. Шмаков // Turczaninowia – 2018. – V. 4. – С. 78–86.

4. Lütken, H., Meropi-Antypa, N. et al. Hairy Root Cultures of Rhodiola rosea to Increase Valuable Bioactive Compounds. / Lütken, H., Meropi-Antypa, N., Kemp, O., Hegelund, J. N., & Müller, R. // Production of Plant Derived Natural Compounds through Hairy Root Culture – 2017. – p. 65–88.

5. Tasheva K, Kosturkova G. The role of biotechnology for conservation and biologically active substances production of Rhodiola rosea: endangered medicinal species / Tasheva K, Kosturkova G // Sci World J – 2012. – p. 13–17.

6. György, Glycoside production by in vitro Rhodiola rosea cultures / Z. György // Acta Universitatis Ouluensis C Tehnica – 2006. – V 266.

7. V. Kapchina-Toteva and L. Sokolov. In vitro micropropagation of Rhodiola rosea L., / V. Kapchina-Toteva and L. Sokolov //  Annuaire de L’Universite de Sofia St. Kliment Ohridski – 1997. – V. 88. – p. 222–226.

8. K. Tasheva and G. Kosturkova, Rhodiola rosea in vitro cultures peculiarities / K. Tasheva and G. Kosturkova // Biotechnology – 2010.

9. Himmelboe M., Lauridsen U. B. et al. Agrobacterium rhizogenes mediated transformation of Rhodiola sp. – An approach to enhance the level of bioacyive compounds / Himmelboe M., Lauridsen U. B., Hegelund J. N., Müller R., & Lütken H. // Acta Horticulturae – 2015. – p. 143–149.

10. Kyndt T et  al. The genome of cultivated sweet potato contains Agrobacterium T-DNAs with expressed genes: an example of a naturally transgenic food crop / Kyndt T et  al. // Proc Natl Acad Sci – 2015 – p. 5844–5849.