Ключевые реагенты применяемые в твердофазном синтезе пептидов

Key reagents used in solid phase peptide synthesis

Автор: Голосов Роман Дмитриевич

8 научная рота Главного военно-медицинского управления РФ, Санкт-Петербург, Россия

Email: rom.golosov@yandex.ru 

Golosov Roman Dmitrievich

8-th scientific company Main Military Medical Directorate of the Russian Federation, St. Petersburg, Russia

Email: rom.golosov@yandex.ru 

Аннотация: Исключительное биологическое значение веществ пептидной структуры привлекает внимание ученых многих стран мира. Изучение химии пептидов создает фундамент для выяснения строения и механизма биологического действия белковых веществ. На сегодняшний день область биохимии может похвастаться широким спектром нового технического оборудования, многочисленными модификациями синтезов и многообразием различных реагентов. Важно отменить, что вариативность методов синтеза предоставляет широкие возможности для оптимизации синтеза конкретного пептида для достижения высоких показателей выхода и чистоты продукта за счет использования наиболее приемлемых реагентов.

Abstract: The exceptional biological significance of substances with a peptide structure attracts the attention of scientists from many countries of the world. The study of the chemistry of peptides creates the foundation for elucidating the structure and mechanism of the biological action of protein substances. Today, the field of biochemistry boasts a wide range of new technical equipment, numerous syntheses modifications and a variety of different reagents. It is important to note that the variability of synthesis methods provides ample opportunities for optimizing the synthesis of a particular peptide to achieve high yields and product purity through the use of the most acceptable reagents.

Ключевые слова: пептиды, твердофазный синтез, реагенты.

Keywords: peptides, solid phase synthesis, reagents.

Тематическая рубрика: Химия и материаловедение.

В настоящее время соединения пептидной структуры находят широкое применение во многих областях деятельности человека: в научных исследованиях, в медицине, фармацевтике, косметике, пищевой промышленности и тд. Это связано с исключительным биологическим значением веществ пептидной структуры, выполняющих в живом организме самые различные функции [1].

Число известных науке сравнительно простых по строению пептидов, обладающих высокой и разносторонней физиологической активностью, исчисляется сейчас многими тысячами и продолжает неуклонно расти. В то же время изучение химии пептидов создает фундамент для выяснения строения и механизма биологического действия белковых веществ.

Термин «пептиды» был предложен известным химиком Эмилем Фишером (1852-1919 гг.). По размеру молекулы и своим свойствам пептиды стоят между высокомолекулярными белками и аминокислотами. Наиболее распространены линейные пептиды, однако известны также циклические пептиды, молекулы которых могут иметь различные размеры [2].  

Образование пептидов в организме происходит в течение нескольких минут, химический же синтез в условиях лаборатории — это достаточно длительный процесс, который может занимать несколько дней, а разработка технологии синтеза— несколько лет. Однако, химический синтез пептидов экономически выгоден. Большинство терапевтических препаратов стоили бы в десятки раз больше, если бы были сделаны на основе природного продукта. С синтетической точки зрения пептиды могут быть получены твердофазным или классическим методами, однако основным является твердофазный синтез пептидов. Впервые твердофазный синтез пептидов (SPPS), представил Брюс Меррифилд и за «разработку методики химического синтеза на твердом носителе» он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1984 году [3].

Первый N-защищенный дипептид был синтезирован Теодором Курциусом в 1881 году, а уже в 1901 году Эмилем Фишером был получен первый дипептид глицилглицин (Нобелевская премия по химии 1902 года), также им были введены такие термины, как «пептид» и «пептидная связь» [4]. Тридцать лет спустя, в 1932 году, Леонидас Зервас разработал карбобензокси защитную группу, которая активно используется в пептином синтезе. В 1953 году Винсент дю Виньо сообщил о синтезе в растворе эндогенного циклического нонапептидного гормона окситоцина, за что был удостоен Нобелевской премии в 1955 году [5].

Десять лет спустя, в 1963 году, Брюс Меррифилд представил твердофазный синтез пептидов (SPPS), за разработку которого он был удостоен Нобелевской премии по химии в 1984 году. Методика SPPS была настоящей революцией, открывшей новые горизонты в области пептидной и белковой химии. Этот простой метод, основанный на иммобилизации защищенных аминокислот на твердофазную подложку, упрощает процедуру, делая синтез пептидов совместимым с автоматическими процессами, обеспечивающими крупномасштабное производство.  

К недостаткам твердофазного синтеза можно отнести: использование больших избытков реагентов, сложность контроля качества промежуточных продуктов и высокая стоимость реактивов, в том числе полимерных носителей, стоимость которых определяется в первую очередь стоимостью линкера [6].  

Последовательный твердофазный синтез предполагает поэтапное присоединение аминокислотных остатков, однако для сокращения общего времени синтеза и уменьшения используемых избытков реагентов возможно применение конвергентного синтеза, который предполагает разбиение целевого пептида на фрагменты с последующей их конденсацией, которая может быть проведена как твердофазным методом, так и в растворе. 

Ключевую роль в синтезе пептидов играет выбор носителя, на который происходит непосредственная иммобилизация первой аминокислоты. В первую очередь, твердый носитель должен быть устойчив к механическому перемешиванию в широком диапазоне растворителей и температур, а также набухать в широком спектре растворителей, чтобы реагенты могли легко получить доступ к активным участкам. Выбор защитных групп, связующих реагентов и условий расщепления непосредственно связан с выбором полимерного носителя и линкера.

В зависимости от функциональной группы полимера существует три типа смол: смолы на основе полистирола (PS) - широко используются в синтезе коротких и средних по длине пептидов; смолы на основе функционализированного полиэтиленгликоля (PS-PEG) и чистые PEG-смолы - используются в синтезе средних и длинных пептидов или пептидов со «сложными последовательностями». 

В случае полистирольной смолы, полимер обычно сшивается с 1% дивинилбензола (DVB). Этот тип полимерного носителя хорошо разбухает в таких растворителях, как дихлорметан (DCM), толуол, N,N-диметилформамид (DMF), диоксан, тетрагидрофуран (THF) и N-метил-2-пирролидон (NMP). Однако эта смола не совместима с водой или другими полярными растворителями. В случае синтеза с участием высокогидрофобных аминокислот или сложных пептидных последовательностей - следует выбирать более гидрофильные твердые носители, например, тентагель (TG), который применим для синтеза как в полярных, так и в неполярных растворителях. Тентагель является наиболее хорошо изученной PEG-PS смолой на сегодняшний день. Смолы TG получают путем прививания PEG-цепей (50%-70%) к полистиролу малой сшивки, с помощью эфирных связей. 

Третья группа полимерных носителей - гидрофильные смолы на основе PEG, которые не содержат полистирола или очень малое его количество. Эта группа включает полимеры, которые очень хорошо набухают в воде, что дает преимущество для изучения взаимодействий пептидных белков, когда содержание белка достигает 35-70 kDa. Главными представителями этой категории являются PEGA (сополимер акриламид-PEG) и CLEAR (сшитая этоксилатакрилатная смола) [7]. Смолы PEGA очень чувствительны при сушке, и поэтому они поставляются набухшими в этаноле.  

Новый тип полимерного носителя под названием ChemMatrix (CM) сочетает в себе преимущества двух предыдущих полимеров, а именно химическую стабильность полистирольных смол и универсальность PEG-привитых смол, что делает его мощным инструментом для синтеза крупных пептидов или сложных последовательностей со многими гидрофобными аминокислотами [8]. 

Большинство вышеперечисленных полимерных носителей продаются с различными линкерами (Rink амидный линкер, Sieber амидный линкер, PAL линкер, Wang HMPA линкер, 2-Хлортритилхлорид), которые непосредственно обеспечивают ковалентную связь между пептидной цепью и твердым носителем, также линкер играет роль защитной группы для С-концевой карбоксильной группы. Кроме того, линкер используется для модификации С-конца пептида и определяет оптимальный выбор защитных групп, связывающих реагентов и условий расщепления [9]. Например, линкеры могут подразделяться на низко и высоко кислотно-лабильные, что позволяет при необходимости отщеплять от смолы полностью защищенный пептид для проведения дальнейших модификаций соединения.

В настоящее время в твердофазном синтезе пептидов широко используются соединения [10], активирующие карбоксильную группу in situ, что обусловлено простотой их использования, минимальным количеством побочных реакций, а также относительно быстрым проведением реакции между стерически затрудненными аминокислотами. Оптимальный выбор необходимого связывающего соединения может зависеть как от строения целевого пептида, так и от растворимости, стабильности или реакционной активности самого конденсирующего агента [11].

По итогам проработки научной литературы можно сделать выводы, что химия пептидов является актуальным разделом современной биоорганической химии. Многообразие химических реагентов открывает возможность использования различных подходов к синтезу биологически активных соединений, что обуславливает быстрое развитие этой области химии, а также вариативность стратегии твердофазного синтеза, что предоставляет широкие возможности для оптимизации синтеза конкретного пептида для достижения высоких показателей выхода и чистоты продукта.

Список литературы:

1. Fosgerau K. Peptide therapeutics: current status and future directions / K. Fosgerau, T. Hoffmann // Drug Discov. Today. —2015. – Vol. 20, No. 1. –P. 122ؘ–128.

2. Шредер Э. Пептиды / Э. Шредер, К. Любке; пер. с англ. под ред. М.М. Шемякина. – М.: Мир, 1967. – Т.1. – 496 с.

3. Amblard M. Methods and protocols ofmodern solid phase peptide synthe-sis / M. Amblard, J.A. Fehrentz, J. Martinez, G. Subra // Mol. Biotechnol – 2006. – Vol. 33. – № 3. –P. 239–254.

4. Mitchell A.R. Bruce Merrifield and solid-phase peptide synthesis: a historical assessment / A.R. Mitchell // Biopolymers. – 2008. – Vol. 90, No. 3. – P. 175-184.

5. Sachdeva S. Peptides as “drugs”: The Journey so far / S. Sachdeva // International Journal of Peptide Research and Therapeutics. — 2017. – Vol. 23, No. 1. – P. 49 – 60.

6. Стюарт Дж. Твердофазный синтез пептидов / Дж. Стюарт, Дж. Янг; пер. с англ. Мишина Г.П. под ред. проф. Швачкина Ю.П. - М.: «МИР», 1971. - 176 с.

7. Merrifield R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide/ R.B. Merrifield// J. Am. Chem. Soc. – 1963. – Vol. 85. – P. 2149–2154. 

8. Garcı F. ChemMatrix, a poly (ethylene glycol)-based support for the solid-phase synthesis of complex peptides / F. Garcı // J. Comb. Chem.—2006. – Vol. 8, No. 2. – P. 213 – 220.

9. Sabatino G. Assessment of new 6-CI-HOBt based coupling reagents for peptide synthesis. Part 1: Coupling efficiency study / G. Sabatino, B. Mulinacci, M. C. Alcaro, M. Chelli, P. Rovero, A. M. Papini // Letters in Peptide Science. — 2002. – Vol. 9. – P. 119-123.

10. Felix A.M. Applications of BOP reagent in solid phase synthesis / A.M. Felix, C. Wang, E.P. Heimer and A. Fournier // Int. J. Peptide Protein Res. – 1988. – Vol. 31. – P. 231-238.

11. Abdelmoty I.  Structural studies of reagents for peptide bond formation: Crystal and molecular structures of HBTU and HATU / I. Abdelmoty, F. Albericio, L. A. Carpino, B. M. Foxman, S. A. Kates // Letters in Peptide Science. —1994. – Vol. 1. – P. 57-67.